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舞台は1936年。プリンストン大学で教鞭を執る高名な考古学者インディアナ・ジョーンズ教授（インディ）には、世界中の宝物を探し発見するというトレジャーハンターとしての顔があった。ある日、陸軍諜報部よりインディの下にナチス・ドイツがタニスの遺跡を発見して聖櫃（アーク）の発掘に着手したという情報が舞い込む。また情報部が傍受したドイツ軍の電報によれば、聖櫃の在り処を示す重大な手がかりラーの杖飾りはインディの恩師であるアブナー・レイヴンウッド教授の手にあるという。何としてでもナチスより先に聖櫃を手に入れろとの依頼を受け、インディは聖櫃の争奪戦に臨む。

1957年、大学で学生たちに考古学を教えているジョーンズ博士(ハリソン・フォード)は、超常現象的なパワーが宿っているという秘宝“クリスタル・スカル”を求め、相棒の若者マット・ウィリアムズ(シャイア・ラブーフ)とともに再び冒険の旅へと出る。しかし、インディたちの前に、秘宝を付け狙うロシア軍が立ちはだかり…。